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Dental Tribune Italian Edition No. 9, 2016

21Dental Tribune Italian Edition - Settembre 2016 Teknoscienza Concentrated Growth Factors (CGF): protocollo e caratterizzazione Il CGF (Fig. 1) è un concentrato pia- strinico autologo, inizialmente svi- luppato da Sacco nel 2006, ottenuto da un semplice prelievo di sangue venoso, successivamente sottoposto a uno standardizzato protocollo di separazione per mezzo di un’apposi- ta centrifuga (Medifuge 200, Silfra- dent, Forlì, Italia), senza l’aggiunta di sostanze esogene. La principale ca- ratteristica del CGF risiede nella sua consistenza: si tratta, infatti, di una matrice organica ricca in fibrina, in grado di “intrappolare” piastrine e leucociti e rilasciare fattori di cresci- ta; elementi che insieme svolgono un ruolo importante nei processi di rigenerazione. Se, da una parte, i fat- tori di crescita rilasciati dalle piastri- ne e dai leucociti sono importanti per stimolare la rigenerazione cellulare, dall’altra, la rete di fibrina costituisce un valido scaffold temporaneo. Come si prepara il CGF Il CGF è ottenuto tramite un sem- plice prelievo di sangue, utilizzando provette in polietilene rivestite con micro particelle di silice, o in vetro, senza l’aggiunta di sostanze esogene (Fig. 2). Una volta eseguito il prelievo, i campioni di sangue vengono imme- diatamente centrifugati, utilizzando un’apposita centrifuga (Medifuge, Sil- fradent) (Fig. 3). Oltre alla centrifuga dedicata, il mate- riale necessario per preparare il CGF è il seguente: 1. disinfettante; 2. laccio emostatico; 3. ago da prelievo (Butterfly); 4. cerotti; 5. provette Vacuette (Greiner Bio- One, GmbH, Kremsmunster, Au- stria) o provette in vetro (Silfra- dent, Forlì, Italia); 6. rack porta provette. Centrifuga CGF Medifuge (Silfradent) Caratteristiche: - centrifuga da banco dedicata alla produzione di CGF, con un appo- sito rotore a velocità alternate e controllate, con un’accelerazione sempre al di sotto di 300 RCF; - il dispositivo medicale Medifuge, consente di utilizzare fino a 8 pro- vette, a gruppi di due, per la prepa- razione del CGF; - un sistema di controllo a micro- processore consente di mantenere la velocità costante; - l’eccezionale sistema del rotore con autoventilazione protegge il prelievo ematico da un eccessivo innalzamento della temperatura. Il vano porta rotore, lo sportello di chiusura e le camicie portaprovet- te garantiscono la sicurezza biolo- gica in termini di biocontenimen- to, in caso di rottura accidentale delle provette; - le camicie portaprovette e il rotore sono costruiti in materiale termi- co-antistatico e antimagnetico, facilmente pulibile, estraibili e ste- rilizzabili in autoclave a 135°; - Medifuge è dotata inoltre di un ci- clo di decontaminazione con luce riflessa UVC, della durata di 5 mi- nuti a 1000 giri; - il motore a controllo elettronico e la sua componentistica interna non richiedono una manutenzio- nespecifica.Illivellodirumorosità èaldisottodeglistandardrichiesti e non supera i 57 dBA. Protocollo di centrifugazione per il CGF (one step protocol) 30’’ accelerazione 2’ 2.700 rpm/735 g 4’ 2.400 rpm/580 g 4’ 2.700 rpm/735 g 3’ 3.000 rpm/905 g 33’’ decelerazione e stop Al termine della centrifugazione, in ciascuna provetta di sangue si posso- no evidenziare tre strati (Fig. 4): 1. uno strato superiore, che rappre- sentalafaseliquidadelplasma,de- nominata “plasma povero di pia- strine”(PPP–PlateletPoorPlasma); 2. uno strato inferiore, costituito principalmente da eritrociti (RBC – Red Blood Cells); 3. uno strato intermedio, denso e gelatinoso, che rappresenta il CGF, che si continua inferiormente con la parte rossa. Biologia del CGF IlCGFècostituitodaunaretedifibrina che “imbriglia” molti componenti cel- lulari del sangue, che ne determinano le attività terapeutiche di tipo rigene- rativo. Rete di fibrina L’utilizzodellamicroscopiaelettronica (SEM – Scanning Electron Microscopy) hapermessodiosservarechelaretedi fibrina del CGF è costituita da elemen- ti fibrillari sia sottili sia spessi (Rodella et al., 2011). Inoltre, la rete di fibrina si presenta fortemente compatta con maglie strette, in prossimità dell’in- terfaccia tra la parte bianca e la parte rossadelCGF,mentrediventapiùlassa a mano a mano che ci si allontana da questa (Borsani et al., 2015). Cellule del sangue Nel CGF sono presenti eritrociti, leuco- citi e piastrine. Gli eritrociti sono pre- senti nella parte rossa del CGF; i leu- cociti sono localizzati principalmente nell’interfaccia tra la parte bianca e la parte rossa del CGF (Fig. 5). Lepiastrinesonolocalizzateprincipal- mente in prossimità dell’interfaccia tra la parte bianca e la parte rossa, seb- bene degli aggregati piastrinici siano presenti in tutto il CGF (Fig. 6). Rilascio “in vitro” di fattori di crescita dal CGF La cinetica di rilascio “in vitro”, di alcuni fattori di crescita del CGF ha permesso di osservare che questa è specifica per ciascun fattore (Borsani et al., 2015). Alcuni di essi, come TNF-a, hanno un rilascio rapido e raggiungono il mas- simo accumulo dopo un giorno; altri, come IGF-1 e BMP-2, hanno un rilascio piùlentoeraggiungonoilmassimoac- cumulo dopo 6-8 giorni; altri ancora, come TGF-b1 e BDNF, hanno un accu- mulo costante. Applicazioni “in vitro” del CGF Il CGF è stato testato “in vitro” su di- verse linee cellulari, mostrando delle ottime capacità proliferative. In parti- colare è stato utilizzato su: - cellule di midollo osseo di ratto (Takeda et al., 2015; Honda et al., 2013); - cellule staminali del legamento parodontale (Yu et al., 2014); - fibroblasti, osteoblasti e cellule endoteliali umane (Borsani et al., 2015); - cellule di Schwan (Qi et al., 2016). <> pagina 22 Fig. 1 - Concentrated Growth Factors (CGF). Fig. 2 - Materiali per la preparazione del CGF. Fig. 3 - Medifuge 2000 Silfradent. Fig. 4 - Strati presenti nella provetta dopo centrifugazione. Fig. 5 - Distribuzione di eritrociti e leucociti nel CGF. Fig. 6 - Immunoistochimica delle piastrine per CD61.

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