14 CAS CLINIQUE Implant Tribune Édition Française | Février 2019 Photodommages de cellules souches de pulpe dentaire pendant l’exposition au laser 700 fs Pr Karsten König et le Dr Anton Kasenbacher Matériel et méthodes ont été traitées Les cellules souches humaines de pulpe dentaire d’adultes (fournies par S. Gron- thos, NIH, Bethesda, États-Unis) ont été cultivées dans un milieu Eagle modifi é (MEM) par Gibco BRL Life Technologies (Paisley, Écosse) avec ajout de FCS à 20 %, L-glutamine 2 mM, L-ascorbate-2-phos- phate 100 µM, pénicilline 100 µg/mL et streptomycine 100 µg/mL dans une atmos- phère de CO2 à 5 % et à 37 °C, dans des fl a- cons pour culture cellulaire (Greiner, Frickenhausen, Allemagne) de 25 mL et 75 mL. Pour les expériences et la culture, les cellules avec de la trypsine à 0,25 %, du glucose 5 mM, de l’EDTA à 0,05 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 5 minutes à 37 °C. Après avoir été décollées de la base des fl acons de culture, les cellules ont été incubées dans des chambres de culture cellulaire (MiniCeM, JenLab GmbH, Jena, Allemagne) pour un examen par mi- croscopie laser. Des études comparatives ont été menées sur des cellules d’ovaires de hamster chinois (CHO), que l’on peut se procurer dans de nombreux laboratoires internationaux pour servir de cellules de référence. Les cellules CHO ont été incubées dans un milieu de Dubeccos – HAM’S F12 (Gibco BRL) avec ajout de FCS à 10 %, de L-glutamine et d’un mélange d’antibio- tiques constitué de pénicilline, de strep- tomycine et d’amphotéricine B dans une at- mosphère de CO2 à 5 % et à 37 °C. La trypsi- nisation concernait les cellules souches. Les cellules individuelles ont été mar- quées par des certaines gravures au dia- mant sur la face externe du verre de la fe- nêtre. En cas de détection de dommages cel- lulaires, ces gravures étaient aisément iden- tifi ées grâce à la technique de contraste de phase. Microscopie laser Un laser titane-saphir (Ti-Sa) 80 MHz, Mai Tai (Spectra Physics, Mountain View, États-Unis) a été utilisé pour effectuer l’exa- men microscopique au laser femtose- condes dans le spectre du proche infra- rouge. La puissance du laser à l’entrée du microscope et au niveau du plan objectif (puissance au niveau de l’échantillon) a été déterminée par l’appareil de mesure de puissance/énergie Fieldmaster (Coherent, Santa Clara, États-Unis) et la tête de capteur au silicium LM-2, le cas échéant modulés par des fi ltres gris. Les valeurs mesurées ont été spécifi ées comme étant des valeurs cor- rigées dans le protocole présenté. Cette cor- rection résulte d’une surface de mesure li- mitée et de conditions d’exposition au rayonnement modifi ées dans le milieu par rapport à l’air. La microscopie laser a été réalisée au moyen d’un microscope modifi é LSM 410 (Zeiss, Jena, Allemagne) muni d’un objectif 40 x/1.3 à immersion dans l’huile. Le mode de balayage du microscope 512 x 512 avec durée de balayage laser de t = 16 s a été utilisé pour exposer les cellules au rayonnement. Celles-ci ont été scannées dix fous au niveau du même plan focal. Ces expériences ont été réalisées à une longueur d’onde centrale de 800 nm. Après l’exposition au rayonne- 1 Fig. 1: Système laser femtosecondes avec unité d’étirement des impulsions. ment, les cellules ont été transférées dans un incubateur afi n de garantir des conditions optimales à la croissance, à la division cellu- laire et au processus de réparation. Unité d’étirement des impulsions, génération et mesure des impulsions de 700 femtosecondes (fs) Afi n d’augmenter la durée d’impulsion au niveau de l’échantillon jusqu’à 700 fs, une unité d’étirement des impulsions a été ins- tallée dans le faisceau de lumière à l’avant du microscope. Cette unité est constituée de miroirs revêtus et de deux réseaux de dif- fraction pulvérisés avec de l’or, agencés en parallèle avec une constante de diffraction de 600 lignes/mm. Le second réseau a été monté sur une platine motorisée avec une précision micrométrique. La durée des im- pulsions a été modulée en fonction de la distance des réseaux. Le faisceau laser a fait l’objet d’une dispersion spatiale par le pre- mier réseau, qui a été compensée au niveau du second (Fig. 1). La durée d’impulsion a d’abord été déter- minée à la sortie du laser à l’aide de l’auto- corrélateur, modèle Mini (APE, Berlin, Alle- magne), à 88 fs à une longueur d’onde cen- trale d’émission de 750 nm, 80 fs à 800 nm et 91 fs à 850 nm, hypothèse faite de la pré- sence d’une fonction gaussienne. Générale- ment, les mesures au niveau du plan focal de l’objectif s’avèrent complexes en raison d’une divergence des faisceaux. Une diode de mesure plane non linéaire a donc été utilisée, ce qui a simplifi é la mesure au plan focal des objectifs à grande ouverture. La fonction d’autocorrélation (ACF), qui peut être adaptée au moyen de programmes d’analyse par la méthode de Gauss, de Lorentz ou de la sécante hyperbolique pour défi nir la durée d’impulsion. Test LIVE/DEAD® L’examen de la vitalité des cellules souches de pulpe dentaire (DSPC) a fait appel à des sondes moléculaires (Eugene, Oregon, États-Unis). Un mélange de calcéine AM 2 µM et de l’homodimère d’éthidium D1 4 µM a été ajouté aux chambres de culture cellulaire suivi d’une incubation de 20 min à 37 °C. Les cellules vivantes ont été colorées à la calcéine (qui émet dans le spectre vert), les cellules mortes l’ont été au moyen de l’homodimère d’éthidium D1 qui émet dans le spectre rouge (noyau). La calcé- ine AM n’est pas un colorant fl uorescent qui s’infi ltre facilement dans la membrane cel- lulaire des cellules vivantes et elle est trans- formée par une réaction enzymatique en calcéine émettant une forte fl uorescence verte incapable de traverser la membrane cellulaire intacte. L’homodimère d’éthidium D1 est un agent de coloration des cellules mortes qui émet une fl uorescence rouge. Il peut uniquement pénétrer dans les membranes cellulaires endommagées et son intensité est fortement augmentée par la liaison à l’ADN. Le kit LIVE/DEAD® a été incubé durant 5 heures et demie après l’ex- position au rayonnement. La fl uorescence a été déclenchée par une excitation à deux photons. 2 Fig. 2 : Taux de dommages induits par laser (létalité).